ساخت سازه کلروپلاستی حاوی ژن دخیل در تحمل به تنش های غیر زنده (fld) و انتقال آن به برنج

تنش های غیر زیستی از جمله خشکی و شوری اولین عامل کاهش محصول در دنیا است. در این تحقیق ژن بتائین آلدهید دهیدروژناز(badh) هم به عنوان یک نشانگر غیر آنتی بیوتیکی و هم به عنوان یکی از ژن های کاندید در تحمل به تنش های غیر زیستی به همراه ژن فلاودکسین(fld) در ساخت وکتور کلروپلاستی برای گیاه برنج مورد استفاده قرار گرفت. سپس طراحی کاست ژنی برای ژن های fld وbadh تحت نواحی تنظیمی کلروپلاستی انجام شد، به طوری که ژن fld همراه با rbcl 5utr و ژن badh همراه با t7gene10 5utr به صورت پلی سیسترونی تحت پیشبر قوی کلروپلاستی prrn و پایانبر rbcl 3utr کلون سازی شدند. سرانجام کاست کامل دو ژنی fld/badh به همراه نواحی تنظیمی از وکتور نوترکیب حاصل موسوم به pbf جدا و در مرکز ناحیه هدف گیری کننده به کلروپلاست برنج در دو جهت کلون سازی گردید. در این تحقیق به منظور تولید گیاه برنج تراریخته متحمل به تنش های غیر زنده به روش اگروباکتریوم از سویه eha105 وحامل پلاسمیدی p6-ubi استفاده شد. این وکتور حاوی ژن نشانگر باکتریایی استروپتومایسین و نشانگر گیاهی هیگرومایسین و ژن فلاودکسین (fld) می باشد. بدین منظور از کالوس های جنین زای برنج رقم هاشمی به عنوان بافت هدف استفاده شد. پس از آلوده کردن کالوس ها با سوسپانسیون باکتری، کالوس ها به محیط هم کشتی انتقال داده شد. گیاهان باززا شده محلول یوشیدا منتقل شدند. آنالیزpcr باپرایمر های virg، عدم آلودگی به اگروباکتریوم، و با پرایمر های fld نشان داد، حداقل یک نسخه از ژن fld در ژنوم این گیاهان وجود دارد. در روش دوم به منظور دستیابی به برنج تراریخته فاقد ژن نشانگر آنتی بیوتیکی، از پلاسمید های کلروپلاستی (pfrfb(- و pfrfb(+) ساخته شده استفاده شد. این پلاسمید ها به روش ریزپرتابه منتقل شدند. پس از بمباران کالوس‎ها به محیط کشت باززایی ms انتقال یافتند.آنالیزpcr باپرایمر های fld نشان داد، حداقل یک نسخه از ژن در ژنوم این گیاهان وجود دارد.